免疫組化技術由于具有特異性強、敏感性高、定位準確的特點，對于疾病的診斷與鑒別診斷有著重要意義，當免疫組化結果沒有出現預期的效果時，應系統的分析和查找原因，找到有效的解決辦法。
IHC實驗步驟繁瑣，包括切片制作（固定，脫水，透明，包埋，切片，貼片，烤片），脫蠟，水化，阻斷，抗原修復，封閉，一抗孵育，二抗孵育，顯色，復染，封片和分析等，在上次的推文中向您介紹了切片制作和抗原修復兩個步驟中的常見問題及解析，本次為您帶來的是封閉和一抗孵育中的注意事項。文末還附有IHC通關的秘密武器——Bioss全新上市的IHC即用型試劑盒，助您一次獲得文獻級的圖像結果。
封閉
1.圖片背景值過高。
解決方法：①在使用抗體前采用溶于甲醇或水的3% H2O2或使用專門的試劑盒進行淬滅，并使用堿性磷酸酶抑制劑，以減少內源性過氧化物酶或磷酸酶的干擾；
②使用生物素類的二抗系統來檢測如腎臟和肝臟等富含生物素的組織樣本時，可以在一抗孵育前用親和素/生物素封閉試劑進行封閉，以減少內源性生物素活性的干擾；
③在加入抗體前把多余的緩沖液吸干，而非對組織樣品進行洗滌，以減少來自內源性酶的干擾；
④蛋白封閉時間不足導致背景增強甚至出現假陽性，應選擇合適的封閉液，適當延長封閉時間；
⑤所用血清溶血，應選擇合適的封閉液。
2.染色結果呈假陰性。解決方法：①封閉時間過長導致陽性信號減弱甚至出現假陰性，應選擇合適的封閉液，適當減少封閉時間；②血清封閉液和一抗來源種屬相同，血清中的抗體可能和目的蛋白特異性結合了，進而導致一抗沒有結合位點，產生假陰性。
3.目標蛋白定位異常。解決方法：①熱滅活正常血清或BSA對組織進行封閉孵育。
一抗孵育
1.圖片背景值過高。
解決方法：①抗體孵育后洗滌不充分，殘留抗體導致背景染色，建議增加抗體孵育后的浸洗次數，延長浸洗時間。
2.染色結果過強。解決方法：①一抗濃度過高是常見原因之一，可適當調整抗體稀釋比；②一抗孵育溫度高，時間長，一般建議4℃過夜孵育，低溫雖然會使抗體結合緩慢，但特異性結合更好。
3.陽性檢測率及著色強度相對減弱，甚至無染色。解決方法：①抗體效價不高。可通過增加抗體使用濃度，延長抗體孵育時間進行調整；②所用抗體不適用于IHC實驗。建議在非變性WB上測試該抗體，以確保抗體識別非變性抗原，或是選用通過IHC實驗驗證的抗體；③一抗二抗不匹配。使用針對一抗物種來源的二抗，如一抗宿主為rabbit，則須使用anti-rabbit的二抗；④抗體失活。避免將標記熒光基團的二抗放置于光照環境；⑤靶蛋白為核蛋白而抗體不能穿透細胞核時，建議在封閉溶液與抗體稀釋液中加入合適的滲透試劑，例如Triton X-100，以促進抗體滲透到細胞內。
4.染色結果呈弱陽性。解決方法：①適當調整抗體稀釋比，或者選擇染色強度高，高親和力的抗體；②設置陽性組織切片的對照，因為同一蛋白在不同組織中的表達會有很大的差異；③切片在染色過程中抗體過濃或干燥了。切片上遺留了過多的沖洗液，當抗體加至切片上時；等于人為地對抗體進行了進一步的稀釋，滴加試劑前應盡量減少殘余液體。
5.染色結果出現非特異性染色。解決方法：①可以通過調整抗體的稀釋比進行改善，特異性強的抗體則不易受稀釋比的影響；②一抗濃度太高，在使用新抗體前可以通過預實驗摸索出最理想的工作濃度，不能簡單地按照說明書來用；③孵育時間過長或孵育溫度過高，建議摸索不同抗體的最佳孵育條件；④一抗非特異性結合過高，可通過降低一抗濃度或縮短孵育時間進行改善；⑤一抗與實驗組織同源，加入二抗后，二抗與組織結合。應換與組織非同源的一抗；⑥一抗為多抗，建議更換為單克隆抗體；⑦抗體稀釋液中添加非離子型去污劑包括Triton X-100或Tween 20減少非特異性疏水相互作用。
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受篇幅限制，本次IHC實驗過程中的常見問題解析就先分享到這里。如果您還想更深入的學習IHC相關問題，可以繼續關注本系列后續文章。如果您在使用我們的產品時出現任何問題，請隨時聯系我們，Bioss資深IHC實驗專家將為您全面講解，深度分析，幫助您輕松解決IHC的“疑難雜癥”！
